Hi，歡迎來到海西儀器城！
- 登錄
- 注冊
- 手機版
APP StoreAndroid版 - 關注精藝
產品信息
| 適用范圍 | 試劑 |
|---|---|
| 使用方法 | 一、試劑配制 1. 培養瓶包被液：18ml PBS加入本試劑盒1支試劑Ⅰ、1支試劑Ⅱ。 2. 增殖培養基：每1000ml免疫細胞無血清培養基中加入本試劑盒1支試劑Ⅴ。 3. 活化培養基的配制：配制完增殖培養基后，取出500ml增殖培養基，加入本試劑盒1支試 劑Ⅳ、1支活化培養基添加物。 二、取材 取材時使用一次性負壓采血管抽取自體外周血 50ml。（建議使用枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑） 或臨床獲得健康新生兒臍帶血。（建議使用枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑）。 三、NK細胞的培養 1. 培養前：T175 培養瓶中加入包被液，2-8℃冰箱過夜，或置于 37℃培養箱中至少包被 2h。 2. 第0天：取出2支高效離心管，分別加入15ml樣本密度分離液，200g離心1min，確保離 心后隔片下充滿分離液，隔片上有0.5-1cm高度分離液。小心將25ml抗凝血緩慢沿管壁 加至分離液界面上，確保血液及分離液之間有明顯界面（每管可加15-25ml血液，若超過 25ml，則分管）。600g，離心30min（也可根據實際情況進行調節），注意慢升慢降。 3. 離心后可觀察從上至下分為4層，淡黃色血漿層，白色環狀PBMC層，分離液層，紅細胞 層。用吸管吸取血漿層，做滅活處理。 滅活步驟：置于水浴鍋中56℃，30min；然后-20℃靜置10min；最后800g，離心 15min，保留上清棄去沉淀，短期保存于4℃備用，長期保存請置于-20℃~-80℃環境下。 4. 用吸管吸取 PBMC 細胞層至 50ml 離心管中，為盡量獲得更多細胞，建議隔片以上部分 全部吸取，注意不要吸到紅細胞。在 PBMC 離心管中加入 PBS 混勻（PBS 量要多于吸取 的 PBMC 體積），600g，離心 10min。棄去上清，加入 PBS 復溶洗滌，300g，離心 10min。 5. 分離出的 PBMC 用未加任何因子的免疫細胞無血清培養基配制成細胞懸液 40ml，加入 1 整套試劑Ⅲ（5 支全部加入），加入 1 支試劑Ⅸ。將上述所有液體加入到棄掉包被液的培 養瓶中，加入 8ml 自體血漿，置于飽和濕度、37℃、5.0% CO2 培養箱中培養。（注：建 議接種密度為 1-3×106 個/ml，如分離后細胞數少，則相對應減少培養基及血漿使用量， 但是活化因子添加量不變。） 注意：先使用完所有活化培養基，再使用增殖培養基。由于個體差異問題，每個樣本生長 速度不一致，添加培養基的時間不一定要嚴格按照以下時間進行，需根據具體情況具體分 析， 確保細胞已經活化成功，呈現聚團生長的情況，細胞數量有增殖。在補加培養基后， 細胞密 度維持在 1×106 個/ml，有利于細胞的生長。 6. 第 3 天加入 40ml NK 活化培養基，加入 5ml 血漿，加入 1 支試劑Ⅸ，1 支試劑Ⅵ。 7. 第5天加入70ml NK活化培養基，加入5ml血漿，加入1支試劑Ⅸ，1支試劑Ⅶ。 8. 第7天將培養瓶中細胞完全吹打下來，輕輕搖勻瓶內培養液，無菌取出0.5ml-1ml細胞液 計數，視細胞生長狀態及細胞密度，建議加入剩余自體血漿并補加剩余的活化培養基。轉 移到1個培養袋。 9. 第9天：輕輕搖勻袋內培養液，無菌取出0.5ml-1ml細胞液計數，視細胞生長狀態及細胞 密度，建議培養袋補加增殖培養基500ml。 10.第11-12天輕輕搖勻袋內培養液，無菌取出0.5ml-1ml細胞液計數，視細胞生長狀態及細 胞密度，建議培養袋補加增殖培養基1000ml 。（細胞總量達到20億時進行此項操作） 11.第13-15天輕輕搖勻袋內培養液，無菌取出0.5ml-1ml細胞液計數，細胞總量達到30億時， 建議培養袋補加增殖培養基1000ml。此時取樣做細菌、真菌、支原體、內毒素檢測。 12.第15-18天輕輕搖勻袋內培養液，無菌取出0.5ml-1ml 細胞液計數，細胞總量達到60 億 時，將1500ml培養液轉移至一個新的3L培養袋中，建議每個培養袋補加增殖培養基1500 ml。此時取樣做細菌、真菌、支原體、內毒素檢測。 13.第18-21天，收集NK細胞懸液6000ml，1500rpm×5min離心后棄去上清液，250ml離 心管集2管每管生理鹽水200ml洗滌（ 1500rpm×8min ）1次 ，再用50ml離心管生理 鹽水 100ml洗滌（1200rpm×5min ）1次，按照100ml生理鹽水+ 8ml 20%人血清白 蛋白重懸細胞，封裝好后備用，同時留樣封存以備日后檢測。 注：分批收獲細胞：擴袋培養時，可收獲一部分的細胞，剩余的部分繼續補加增殖培養基 進行擴增（原則為按照細胞密度補液），客戶可按照方案分批收集或一次性收集。 |
| 注意事項 | 1. 使用前請仔細閱讀本試劑盒說明書，并嚴格按照說明書執行操作。 2. 本試劑盒必須按規定溫度保存，不可反復凍融。試劑在使用前需解凍，并充分混勻，不 可劇烈震蕩。 3. 可視細胞生長的實際狀況適當調整補液時間和用量。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 根據說明書內容，有效期12個月。 |
