產品概述 product description

貝博? BBcellProbe? 細胞外酸化率（ECAR）檢測試劑盒（Extracellular acidification Rate Assay Kit）是利用貝博? 合成的酸化檢測熒光探針BBcellProbe? P61來檢測細胞外酸化情況變化的試劑盒。可以通過簡單的混合基于熒光酶標儀便捷的直接進行細胞外酸化情況的動態實時測定。 細胞外酸化（Extracellular Acidification ；ECA）測量可以為糖酵解（glycolytic）活性研究提供豐富的信息，本試劑盒可用于代謝表征并確定具體的干預措施（如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控）如何影響糖酵解通量。 細胞代謝與癌癥、心血管疾病、神經退行性疾病、肥胖、糖尿病及干細胞等多個領域息息相關。糖酵解是真核細胞中的關鍵代謝途徑，在分化、增殖和 ATP 生成等生理過程中起重要作用。糖酵解的改變對多種疾病也具有重要意義，包括但不限于癌癥、心血管疾病和代謝疾病。 能量代謝指標胞外酸化率（ECAR）可幫助研究人員更多地了解細胞對外界的應激反應和運作機制。但以往細胞代謝的檢測技術存在較多限制，例如難以對細胞代謝進行連續、實時的檢測；一些專門檢測細胞代謝的儀器、硬件貴，試劑耗材消耗成本高，實驗重復性低且只能檢測有限指標。 與傳統的終點糖酵解分析不同， 使用BBcellProbe? P61糖酵解分析可以實時測定細胞外酸化率 (ECAR)，可以觀察糖酵解機制的短暫變化和快速反應。樣品不需要密封處理，在這些條件下， ECAR 是一種可靠且穩定的糖酵解活性測定方法。 BBcellProbe? P61細胞外酸化分析可以實時測量細胞糖酵解活性，是以高通量形式來評估用于代謝表征的細胞呼吸以及評估治療對細胞功能毒性作用的一種可靠方法。 它可以使用熒光酶標儀在標準微孔板上進行簡單動力學測定。隨著糖酵解作用的進行，丙酮酸轉化為乳酸，這將導致細胞外環境 pH 降低。P61探針可以靈敏地檢測到 pH 降低，并表現為BcellProbe? P61探針熒光信號增加，從而實現對ECAR的測定。 BBcellProbe? P61最大激發波長為 488nm，最大發射波長為 580nm。其熒光在堿性條件下強度較弱，反之酸性條件下變強，從而BBcellProbe? P61可被用于監測細胞外酸化的變化。在測定中，細胞外酸化率由熒光信號隨時間的變化計算。細胞外酸化增加，熒光信號的變化率增加；反之，酸化減少，熒光信號的變化率降低。 BBcellProbe? P61與乳酸的這種反應是非破壞性且完全可逆的，BBcellProbe? P61沒有細胞毒性，其是化學穩定的，惰性的，水溶性的和細胞不滲透的，不能透過完整的細胞膜。因此還可以同時與細胞耗氧率， 線粒體膜電位， ROS和細胞ATP 、LDH等檢測的試劑結合使用，進行多參數檢測。 用BBcellProbe? P61進行細胞外酸化檢測方法及其簡單，不需要適用特殊的儀器設備，只需要熒光酶標儀之類的熒光讀板設備即可。 BBcellProbe? P61采用可見光激發檢測，相對于采用紫外光激發的檢測試劑，細胞損傷更低，對細胞的毒害更小。結果更加準確客觀。 貝博? BBcellProbe? 細胞酸化檢測試劑盒可以用于直接，實時分析細胞外酸化情況。本試劑盒可以用來測量各種全細胞（貼壁和懸浮細胞），各種3D培養物，組織，小生物，球體，支架和基質等。 以96孔細胞培養板計，本試劑盒小包裝可以檢測200個樣本。

保存溫度

2-8℃ 避光

注意事項

1.探針-20℃密封避光保存；
2.避免反復凍融。可以根據實驗進度安排小量分裝保存；
3.探針P61需要配制成工作液后使用，注意看操作步驟以及注意事項；
4.檢測緩沖液為無菌試劑，注意防止污染；
5.試劑拆封后請盡快使用完！

有效期

6個月

檢測方法

熒光酶標儀

適用樣本

細胞

產品特點

1.廣泛適用于各種體外模型；不再局限于單層細胞，還能測定懸浮細胞和特定的 3D 培養物；
2.簡單的“混合-檢測”方案允許使用多種其他分析試劑盒進行多參數分析；
3.無損可逆轉，能夠觀察細胞外酸化的瞬態和長時間變化；
4.可適配多數熒光酶標儀以及標準 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地測量； 6.無需等待專用設備空閑所需的實驗室時間，也無需大額資金專用設備投入

產品應用

細胞代謝研究

儀器準備

1.熒光酶標儀
須配備相應的波長過濾器和溫度控制器。
須配備溫度控制器。
2.離心機
3.pH計
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

試劑準備

1.PBS緩沖液或者HBSS ? 2.KOH / HCl
3.對照試劑（選配，非必須）：
Glucose Oxidase，2-Deoxyglucose，寡霉素A，抗霉素A，FCCP

耗材準備

1.黑色透明底熒光專用培養板
2.0.22 μm針頭過濾器
3.離心管
4.吸頭
5.一次性手套

使用注意事項

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。
3.以下操作以96孔細胞培養板為例。其他培養容器或裝置請根據實際情況調整試劑用量和檢測方法。各試劑等比例調整即可。
4.BBcellProbe? P61探針的信號變化直接取決于所測量細胞類型的細胞外酸化速率，建議盡可能使用每孔高的細胞密度作為起點，并根據需要減少細胞數量。
5.并非所有細胞類型都產生足夠用于檢測的酸化。
6.最好使用熒光培養專用的透明底黑色培養板。實在沒有的話可以采用透明板，注意細胞孔間隔開，減少檢測時各孔之間的光互相干擾。
7.用于測定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預熱。
8.盡可能使用多通道移液器添加試劑。
9.建議每個測試樣做3復孔。
10.試劑盒所配的檢測緩沖液不能用其它緩沖液（如PBS/HBSS等）或培養基代替。說明書中所有提到使用檢測緩沖液B的地方必須使用試劑盒所配的檢測緩沖液。
11.待檢測樣本量較多時，可以采用簡化的試劑配制步驟：將100 μL P61探針試劑（母液）添加到9900 μL預熱的檢測緩沖液中（100倍稀釋），并使用多通道移液器，將100 μL稀釋的含P61探針的檢測緩沖液液添加到每個孔中（非空白對照孔，空白對照不含探針）。
12.ECAR/糖酵解測定通常允許同時實時測量多參數（或多重）組合，常與細胞耗氧量（OCR）同時測定（相關產品貨號：BB-48211），分析細胞的代謝表型以及測定糖酵解和線粒體呼吸兩種途徑之間的轉換情況。

使用方法

關于儀器設置：
? 溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務必使用配有溫度控制的酶標儀。
? 常規的熒光信號強度測量，使用基于單色儀或基于過濾器的酶標儀，最佳激發波長使用488 nm或514 nm，發射波長使用580-590 nm。可根據實際機器和樣本選擇信號最強的波長。
? 具有檢測增益參數（PMT，Parameters）的通常設置為中或高。
? 一般使用底部讀數bottom read。


關于細胞培養：
? 對于貼壁細胞，在200 μL培養基中的96孔板中接種細胞。在37 ℃ 的CO2培養箱中孵育過夜。
? 對于懸浮細胞，在檢測當天在100 μL培養基中接種。
? 注意所需的接種密度取決于細胞類型。 我們推薦進行細胞接種密度預實驗以確定最佳密度。通常從高細胞密度（通常為60,000-80,000個）開始，每孔的最佳細胞數一般為：貼壁細胞每孔80,000個細胞，懸浮細胞每孔5-6 x 105（96孔板）。
? 檢測待測樣品都設置3復孔。
? 注意始終在每個96孔板上留出至少6個孔，以免添加細胞作為空白對照和信號控制孔。
? 如果將細胞在CO2培養箱中培養過夜，則去除二氧化碳非常重要，殘留的二氧化碳可能會導致酸化。在進行P61酸化檢測之前先將培養板殘余二氧化碳進行去除，方法是提前通過在37℃，濕度為95％的無二氧化碳培養箱中培養細胞約兩個小時。


關于細胞接種密度測試：
? 對于不同的細胞，對于相同細胞的不同干預模型，最佳的細胞接種密度是不同的。有條件的話坐下細胞接種密度測試可以得到更好的實驗結果。
? （推薦細胞接種密度測試，以下可選，非必須）：
為了確定待測細胞模型的最佳接種密度，在實驗前，選擇一系列細胞接種密度，測定熒光強度與時間函數數據，然后確定正式實驗的接種密度。

關于對照孔設置：
? 一般空白孔要設置，其它對照根據實驗需要決定。
? （推薦對照設置，以下可選，非必須）：


操作步驟：
1. 探針工作液試劑配制：
用試劑B檢測緩沖液10倍稀釋探針P61（母液）（每100 μL P61探針中加入900 μL檢測緩沖液），充分混勻，配制成P61探針工作液，備用。
2. 準備細胞模型。
3. 培養好的待檢測細胞移除培養基，用檢測緩沖液洗滌細胞兩次。每次洗滌每孔使用100 μL檢測緩沖液。
4. 去除第二次洗滌的檢測緩沖液，加入90 μL新的檢測緩沖液。
5. 每孔加入10 μL BBcellProbe? P61酸化熒光探針，充分混勻。
6. （可選）可以在此處添加待測試化合物藥物（通常為1-10 μL）（如果需要的話）。
7. 然后用該細胞板進行熒光細胞外酸化變化情況檢測。用熒光讀板設備讀取該細胞板的熒光數據。
激發波長488 nm，發射波長580 nm-590 nm。
每2分鐘或3分鐘讀取一次。測量時間大于120分鐘。
8. 繪制酸化率曲線。
9. 計算每個樣品的斜率值。

常見問題分析

1.酸化率檢測趨勢跟預期的不一致？
檢查細胞接種和移液的一致性。
增加細胞密度。
將測定體積減少到60微升。
在某些較短的檢測時間區間內，會出現熒光數據的波動情況，出現斜率下降或不變化，需要擴大到更長的時間范圍內來分析酸化率趨勢。一般檢測時間范圍不少于60分鐘。
溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務必使用配有溫度控制的酶標儀，儀器以及所有培養基和儲備溶液均須使用前37℃預熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致，如果存在這種情況，請考慮將測定和平衡溫度降低到30℃。
避開培養板外圈。

2.使用的細胞類型靈敏度不夠？
可以考慮以下改善方案：
增加酶標儀的增益（PMT）設置。
增加BBcellProbe? P61酸化熒光探針的體積（15μL/孔）。
增加細胞密度。
將測定體積減少到60微升。
測量底部讀數（如果有）。
調整TR-F焦距。

3.我無法在含有細胞的孔中檢測到任何信號，或者我可以檢測到信號，但斜率（速率）顯得很低？
檢查正確的儀器設置，設置信號優化。
增加細胞密度。
將測定體積減少到60微升。
避免使用微孔板的外圈孔。