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商品名稱：Small RNA Cloning Kit
商品編號：SPU2021051358
上架時間：2022-01-05
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| ■ 制品內容 (10 次量) |
| □ Package1 (-20℃保存) RNase Inhibitor (40 U/μl)50 μl10X BAP Buffer200 μlAlkaline Phosphatase (BAP) (0.4 U/μl)20 μl0.1%BSA60 μl3’Adaptor*1*210 μlT4 RNA Ligation Buffer600 μlT4 RNA Ligase (40 U/μl)20 μl5X T4 PNK Buffer100 μlT4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK) (10 U/μl)10 μl5’Adaptor*110 μl5X RT Buffer40 μldNTP Mixture (2.5 mM each)90 μlPCR-R & RT-Primer (50 pmol/μl)*1*320 μlRTase (RNaseH free) (200 U/μl)10 μl2X PCR Buffer250 μlPCR Primer F (50 pmol/μl)*110 μlTaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl)10 μlControl RNA (5 pmol/μl)*410 μl□ Package2 (4℃保存) 3M Sodium Acetate (pH 5.2)200 μlDr.GenTLE Precipitation Carrier*580 μl2X B/W Buffer2.7 mlMagnosphere? MS300/Streptavidin100 μlRNase free dH2O10 ml *1 3’Adaptor、5’Adaptor、PCR Primer F及PCR-R、RT-Primer上都帶有Sse8387Ⅰ酶切位點，使用Sse8387Ⅰ酶切后的PCR產物可以與Pst I酶切的載體進行連接克隆。本試劑盒中不備有限制酶和克隆用載體，請另外準備。*2 3’Adaptor已用生物素標記。*3 PCR用的Reverse Primer，也可以作為反轉錄引物使用。*4 Control RNA是一條21mer、5’端磷酸化的RNA。*5 Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094)。 |
| ■ 制品說明 |
| 近幾年的研究表明，在細胞內發現的RNA中有許多是非編碼RNA，它們有著重要的功能，這些RNA被稱為功能性RNA，其中倍受關注的是18-26 個堿基的低分子RNA，這些低分子RNA的功能有：① mRNA水平抑制基因表達。② 翻譯水平抑制基因表達。克隆是分析小RNA的有效方法之一。由于小RNA與mRNA不同，它不具有PolyA tail，因此，在克隆時，需在小RNA的5’端和3’端分別加上RNA接頭或者RNA/DNA雜合形式的接頭，經RT-PCR后進行PCR。本試劑盒主要用于cDNA的合成和小RNA的克隆。試劑盒通過簡單的磁珠吸附操作即可純化小RNA反轉錄得到的cDNA，省去了在接頭連接之后切膠回收等復雜操作步驟。擴增得到的cDNA可以直接用于TA克隆，或者利用接頭中帶有的酶切位點進行克隆。使用本試劑盒對小RNA (Small RNA) 進行克隆時的操作流程見圖1。起始的Small RNA是由總RNA 經過電泳及切膠回收得到的。詳細步驟如下：1. 將Small RNA進行BAP處理，5’端去磷酸化。2. 將帶有生物素標記的RNA/DNA雜合形式的接頭與BAP處理后的Small RNA的3’端進行連接。3. 用標記Streptoavidin的磁珠，回收帶有生物素標記接頭的Small RNA，然后進行5’端磷酸化反應。4. 將5’端連接上RNA/DNA嵌合的接頭后，使用RT Primer和反轉錄酶進行反轉錄反應。5. 從磁珠上回收合成的cDNA后，進行PCR反應。6. PCR片段克隆。 |
| ■ 各種引物及Control RNA的堿基序列 |
| 名 稱切 點酶 例PCR-R & RT-Primer 5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’反轉錄反應及PCR反應的Reverse引物，含有Sse8387Ⅰ的識別序列 (陰影部分)。PCR-Primer F5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’PCR反應的Forward引物，含有Sse8387Ⅰ的識別序列 (陰影部分)。Control RNA 5’p-AGAUGACGGCAACUACAAGAC-3’用于Control反應。 |
| ■ small RNA克隆流程圖 |
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| SmallRNACloningKit | |||
| 品牌 | CodeNo. | 產品名稱 | 包裝量 |
| Takara | RR065 | SmallRNACloningKit | 10次 |
