鈣離子比例成像

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鈣離子是生命活動最重要的離子之一，通過測定細胞內游離鈣離子濃度，科研工作者可以得知肌肉收縮、神經信號傳導、細胞間通訊、激素反應等生命活動的重要信息。目前世界上胞內鈣離子的主流測量方法分為電測量法和光測量法。電測量法利用細胞膜片鉗技術測定鈣電流引起的細胞膜電位的變化。光測量法利用能與鈣離子特異性結合的熒光探針來測定細胞熒光強度的變化。而更為準確和先進的方法則是光電聯合測量法，這兩者相互印證、相互輔助，可以得出離子濃度變化的準確信息。光電聯合測量法利用標準溶液來制作標準曲線，甚至可以測量出胞內鈣離子的絕對濃度，是目前世界上測量胞內游離鈣離子濃度最為權威的方法之一！單細胞膜片鉗測定系統和離子熒光比例測量系統是兩套既互相獨立又協同工作的系統。細胞膜片鉗系統用于測定特定生物反應和生命活動時膜電位的變化，離子熒光比例測量系統用于測量細胞鈣離子濃度的變化及其絕對值。

實驗原理

目前最常用的Fura-2是一種鈣離子熒光指示劑，可與胞內游離鈣離子特異結合，其游離（未結合）形式的Fura-2比與鈣結合形式的Fura-2在更長的波長上被激發，即：結合形式的Fura-2激發波長為340nm，游離形式的Fura-2激發波長為380nm。因此通過檢測兩個激發波長上熒光強度的比率，就可以確定結合鈣的Fura-2與未結合的Fura-2的比例，進而利用Grynkiewicz公式求出游離鈣離子的濃度。 Grynkiewicz公式：[Ca²⁺]i＝Kd×β（R-Rmin）×（Rmax-R）。其中，Kd為Fura-2和鈣離子結合的平衡解離常數，β是胞內零鈣和飽和鈣時在380nm的熒光強度比值，R是Ratio比值，Rmin是零鈣時Ratio值，Rmax是飽和鈣時的Ratio值。 Fura-2法可用于測定組織塊、器官、人工培養的單層貼壁細胞、血小板等多種細胞的胞內游離鈣，此檢測方法定量，具有快速、靈敏等優點。

系統擴展

利用不同的熒光指示劑對不同離子進行染色以后,再利用專業的熒光光源進行激發。該系統可以擴展到測量K、Na、Mg、Cl、H等多種離子的濃度變化。

如果在該系統中增加一套Dual-View多波長分光器，并配合相應的濾色片，即可將兩種不同的發射光一分為二，從而可同時得到同一樣本的雙波長圖象。這樣一來就擴展成為一套FRET熒光共振能量轉移研究系統。可以方便、精確地進行CFP/YFP、GFP/RFP等的FRET測量，也能完成Fluo3、FluoRed同時裝載測定。更是Ind-1測量的最佳選擇。

完整的鈣離子比例成像系統的構成

1. 科研級高靈敏致冷CCD：為離子成像系統的最主要部件。它的靈敏度高低、信噪比大小直接影響到實驗的結果。目前主要可采用的CCD為美國Roper公司生產的CoolSNAP系列、Cascade系列等。

2. 超快波長切換裝置：為熒光指示劑提供激發光源，并能使激發光在不同波長之間快速切換。目前主要采用美國Sutter公司的Lambda 10-2系列、Lambda DG-4系列以及德國TILL公司的Polychrome IV。

3. 分析軟件：帶有CCD、光源等周邊設備軟件控制模塊，2、8、16、24、48位圖像顯示與處理功能模塊，2D反卷集、3D構建、多種形態學參數及距離測量模塊。同時還具有熒光強度比例成像的數據采集與處理功能。目前常用的軟件有美國UIC公司的MetaMorph/Fluor 、美國 Intelligent Imaging Innovations公司的的SLIDEBOOK軟件等。

4. 濾光片組：根據所需測量的不同離子選擇相應的熒光染劑，然后根據所選染劑的特性選擇相應的濾光片組，以獲得我們所需的激發光源。目前普遍采用美國Chroma公司產品。

5. 研究級倒置熒光顯微鏡：可選用各大著名公司的熒光倒置顯微鏡。

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